真菌的鑑定

麥曲在黃酒釀造中起着重要的作用。分析微生物在麥曲中的區系分佈和其中微生物菌羣的系統發育，對於理順麥曲中的微生物與產地環境的相互關係、建立麥曲微生物生態數據庫和麥曲品質的分子評價指標，具有重要的指導意義。

不同培養基進行真菌平板分離的結果

文章來源華夏酒報

為了最大限度地分離出麥曲中的真菌，採用了三種培養基，其中PDA和CPK培養基是用來分離真菌的常用培養基，此外還使用了麥曲浸提液培養基(WQE)，因為它的營養成份近似於微生物最原始的生存環境。對於三種培養基進行平板菌落計數，PDA和WQE培養基上的菌落數在48小時後達到最大，菌落數分別達到4.7×104cfu/g幹曲和8.4×104cfu/g幹曲。而在CPK培養基上，由於本身是合成培養基，營養不夠豐富，所以24小時後開始慢慢形成菌落，56小時後達到最大值，僅為1.4×104 cfu/g幹曲。

不同培養基的麥曲真菌分佈

根據菌落大孝形態和顏色等表型特徵進行初步區分，共得到24株純種菌株。各個純株在3種分離培養基上的分佈情況見表1。從PDA，CPK和WQE三種培養基上分離得到的純種真菌分別為8種、18種和11種。PDA是營養豐富的培養基，但分離出來的真菌數目最少。而近似於微生物最原始生存環境的WQE培養基分離得到的真菌種類，要比預期的少。在合成培養基CPK上分離獲得的真菌種類最多，暗示在低營養長時間的培養條件下，能夠較多地回收得到麥曲樣品中的真菌。

將10—5稀釋度以上檢測到的真菌認為是麥曲樣品中的優勢菌。從表中可以看出，不同的培養基分離出來的優勢菌是不一樣的，且每一種培養基都能檢測到其它培養基所不能檢測到的優勢菌株，所以必須聯合使用多種分離培養基，才能準確解析麥曲中的真菌多樣性。另外，在分離培養基中有必要加入去氧膽酸鈉來抑制菌絲的蔓延。

純種真菌的鑑定

對分離獲得的24株真菌純株進行形態初步鑑定和基於ITS序列的分子鑑定，具體測序結果見表 綜合平板分離和測序的結果可以看出，通過大規模的系統分離培養方法確定麥曲中的優勢真菌為：傘枝犁頭黴(Absidia corymbifera—like)，米麴黴(Aspergillus oryzae)、煙麴黴(Aspergillus fumigatus)、黑麴黴(r)、小孢根黴(Rhizopus microsporus)、微小根毛黴(Rhizomucor pusillus)、季氏畢赤氏酵母(Pichia guilliermondii)和異常畢赤酵母(Pichia anomala)。

本研究分離鑑定出的焦麴黴(Aspergillus ustus)、土麴黴(Aspergillus terreus—like)、泡盛麴黴(Aspergillus awamori)、桔青黴(Penicillium citrimum)、季氏畢赤酵母、異常畢赤酵母，小孢根黴，多變根毛黴(Rhizomucor variabilis)、球毛殼黴(Chaetomium globasum)、阿姆斯特丹散囊菌(Eurotium amstelodami)和Phaeosphaeria fu-ckelii等菌株在以前的研究結果中均未出現。所用的麥曲是人工腳踏成型，此前公司採用培養法對機制麥曲中的真菌進行過研究，機制麥曲中的優勢真菌為傘枝犁頭黴(Absidia corymbifera)、米根黴(Rhizopus oryzae)、微小根毛黴(Rhizomucor pusillus)、米麴黴(Aspergillus oryzae)、煙麴黴(Aspergillus fumigatus)。除了米根黴以外，其餘優勢真菌與本文的`研究結果一致。

人工腳踏成型麥曲中的真菌種類比機械壓制成型麥曲豐富，其原因是人工踩制曲坯能起到提漿作用，賦予曲坯表面較豐富的營養和較好的保温功能，因而比機械壓制成型的曲坯更適合微生物的生長繁殖。

對分離獲得的真菌純株序列進行系統發育分析發現，所分離得到的純種菌株大致分為11個屬，分別是麴黴屬(Aspergillus)、犁頭黴屬(Absidia)、根黴屬(Rhizopusmucor)、毛黴屬(Rhizopus)、青黴屬(Penicillium)、散囊菌屬(Eurotium)、枝孢屬(Cladosporium)、畢赤酵母屬(Pichia)、球毛殼屬(Chaetomium)、念珠屬(Candida)和伊薩酵母屬(Issatchenkia)，反映出紹興黃酒成品麥曲中真菌的資源非常豐富。從屬的分類水平來看，在腳踏曲中出現的屬除了散囊菌屬(Eurotium)、畢赤酵母屬(Pichia)和球毛殼屬(Chaetomium)外，其它的屬在機制曲中均有出現。

本文所得到的序列用菌名加代號表示，來自於GenBank數據庫的序列用菌名加登錄號表示。比例尺代表5%的核酸序列差異性。