細菌分離鑑定

目的要求：

熟悉臨牀標本中常見的病原性細菌的分離鑑定方法。

實驗內容：

一、膿汁、咽拭子等標本中病原性細菌的分離與鑑定

(一)標本採集

1.膿拭子：用無菌棉籤蘸取患處深部膿液或分泌物少許，置入無菌空試管內，送檢。

2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用無菌棉籤挑取膿稠痰塊，置入無菌空試管內，送檢。

3.咽拭子：囑病人把口張大，用壓舌板壓住舌根，用無菌棉籤迅速蘸取咽部分泌物，置入無菌空試管內，送檢。

4.血標本：疑為敗血症患者，在嚴格無菌操作下，靜脈採血，牀旁直接加入含50ml的肉湯瓶內，立即搖勻後送培養。

5.腦脊液：對疑似流腦患者，作腰椎穿刺取腦脊液，立即行直接牀旁接種(送檢過程中應注意保温)。

6.尿道、陰-道分泌物：對可疑淋病患者，男性可從尿道取材，取材時導尿管應進入尿道1cm～2cm，如為剛排尿，應等待1h左右;女性則可以從宮頸口取分泌物，當內窺器插入宮頸口後應稍等片刻，再旋轉取出，取材應立即送檢，不可放置冰箱。

(二)分離鑑定程序

待檢標本可直接做塗片染色檢查鑑定，必要時可做分離培養、生化反應及致病性鑑定。常見的`致病性球菌檢查程序如下。

直接塗片、革蘭染色、鏡檢(形態、排列、染色性)

膿、痰、咽拭子

分泌物、腦脊液 觀察菌落性狀、溶血性、色素

血瓊脂平板→ 塗片、染色、鏡檢

↑ 挑取可疑菌落 生化反應

血液、穿刺液 →肉湯培養基 純分離 致病性測定

↓ 藥敏試驗

如培養液混濁時可塗片、染色、鏡檢

(三)常見臨牀標本的檢查方法

1．膿拭子

在膿汁中除了球菌外，也有桿菌存在，例如革蘭陽性的有炭疽桿菌、白喉桿菌、結核桿菌、枯草桿菌等，革蘭陰性的有大腸桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌等，此外尚可有真菌、放線菌、螺旋體等。

材料

(1) 標本：膿拭子

(2) 培養基：血瓊脂平板

(3) 兔血漿、白色濾紙片、無菌生理鹽水、載玻片

方法 膿汁 → 革蘭染色 → 鏡檢

↓ ↑

血瓊脂平板 →觀察菌落形態及溶血情況

↓

致病力試驗

(1)將膿拭子作革蘭染色，鏡檢(先作培養再塗片以免污染)。標本放置4℃冰箱保存，待報告發出後再丟棄。

(2)將膿汁塗布於血瓊脂平板上，再以滅菌接種環作劃線分離。置培養37℃培養18h～24h。

(3)經培養後據菌落特點及塗片檢查結果進行初步識別，根據需要再作進一步鑑定。若菌落較大、溶血透明、產生金黃色色素、塗片為革蘭陽性球菌併成堆排列時可能系葡萄球菌，應確定其為何種葡萄球菌;必要時再作血漿凝固酶試驗及甘露醇發酵試驗，確定其致病力。

2.咽拭子

咽喉中存在的細菌較多，可以有厭氧及需氧性鏈球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四聯球菌、腦膜炎球菌、卡他球菌、喉桿菌、結核桿菌枯草桿菌、百日咳桿菌肺炎桿菌及綠膿桿菌等。此外也可有白色念珠菌奮森螺旋體等。本實驗以咽拭子作為標本，重點檢查病原性球菌。

材料

(1)標本:咽拭子。

(2)培養基:血瓊脂平板。

方法

咽拭子

↓

血瓊脂平板

↓

觀察菌落形態及溶血性

↓

革蘭染色，鏡檢

取標本塗布於血瓊脂平板，再以滅菌接種環劃線分離，置37℃培養18h～24h培養。標本放置4℃冰箱保存，待報告發出後再丟棄。

可根據下述特點進行鑑別：

(1)在菌落周圍產生2mm～4mm寬、界線分明、完全透明的溶血環、塗片為革蘭陽性球菌並呈鏈狀排列，可能是乙型溶血性鏈球菌。

(2)菌落細孝半透明、有草綠色溶血環、塗片為革蘭陽性球菌呈鏈狀排列，可能為甲型溶血性鏈球菌。需要進一步與肺炎球菌區別時，可做膽汁溶菌試驗及菊糖發酵反應。

菌落細小半透明、不溶血、塗片為革蘭陽性鏈狀排列的球菌時，為丙型鏈球菌。

(4)菌落扁平邊緣隆起、中央稍凹、半透明、呈草綠色溶血、革蘭染色為陽性雙球菌、呈矛頭狀排列時為肺炎球菌，應以膽汁溶菌及菊糖發酵反應與甲型溶血性鏈球菌區分。

(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革蘭染色為陰性雙球菌，呈腎形排列時，可能為腦膜炎球菌，需要進一步作氧化酶試驗及糖發酵試驗(接種於含血清之葡、麥、蔗糖發酵管中)。

二、糞便標本中腸道桿菌的分離與鑑定

(一)標本收集

取患者的糞便或肛-門拭子。

(二)鑑定程序

腸道桿菌為一大羣革蘭陰性桿菌，從形態及染色性上無法鑑別為何種菌，只能依靠生化反應和血清學反應進行鑑定。

患者糞便(粘液、膿血)→腸道選擇、鑑別培養基(如ss、中國藍、伊紅美蘭)

↓

挑取可疑菌落(據大孝顏色、透明度而定)

↓

雙糖鐵及其他鑑別培養基

↓

據結果分析鑑定

↓

玻片凝集(做出特異性診斷)

葡萄糖乳糖動力H2S尿素

⊕⊕±--艾希菌屬非致病菌

⊕+---克雷伯菌屬

⊕±+++變形桿菌

⊕-++-乙型副傷寒致病菌

⊕-+±-甲型副傷寒

+-++-傷寒桿菌

+----痢疾桿菌