公衞執業醫師考點:包蟲病診斷標準附錄C
人體包蟲病免疫學診斷方法有間接紅細胞凝集試驗(IHA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、PVC薄膜快速ELISA等。其中,以ELISA法最為常用且較敏感。現有的包蟲病免疫學試驗方法在敏感性和特異性上存在很大的差異。試驗結果受許多因素的影響:抗原的性質和質量;檢測用的試驗系統;棘球蚴囊的數量、部位和活力;不同地理蟲株差異;個體免疫應答反應的差異等。約10%~40%的手術確診的包蟲病患者用目前已知的抗原檢測不到特異性抗體。本規範中列出了國內外普遍應用的一些方法。
C.1 抗原製備
C.1.1囊液粗抗原:完整的棘球蚴組織表面清洗乾淨消毒後,無菌抽取囊液(宜使用無化膿和無鈣化的可育囊)。將囊液經5000 r/min離心20 min,上清液凍存備用。
C.1.2 純化抗原
可用磷鎢酸、氯化鎂沉澱法對棘球蚴囊液抗原進行部分純化。取20ml離心後的囊液上清,加入2mol/L MgCl2和4%磷鎢酸(用NaOH調節pH至7.5~7.6)各1.2ml;室温攪拌5 min,5000r/min 離心30 min;將沉澱用0.02mol/LpH7.2 PBS溶解;4oC 透析24小時,測定蛋白濃度,~20 oC凍存。
C.2 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
C.2.1 抗原
囊液粗抗原、純化抗原、特異性抗原。
C.2.2 操作方法
抗原包被:用0.05 mol/L pH9.6碳酸緩衝液稀釋抗原至工作濃度,每孔加入100 μl,置温盒4℃過夜。次日,傾去抗原,用含0.05%吐温~20的磷酸鹽緩衝液(0.02mol/L 7.4 PBST)洗滌3次,每次3 min,拍幹;
C.2.22 加待檢血清:血清用含3%BSA的PBST 1∶200稀釋,每孔加入100 μl,每板應設參考陽性一孔,參考陰性三孔及PBS對照一孔。置温盒,37℃ 1 h,取出傾去血清,同前洗滌3次;
加酶標記第二抗體:加入工作濃度的辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗人IgG 100 μl,37℃,1 h,傾去第二抗體,同前洗滌;
加底物顯色:加鄰苯二胺(OPD,橙紅色)或四甲基胺/四甲基聯苯胺硫酸鹽(TMB/TMBS,藍色)底物溶液100 μl,37℃,30 min;
加終止液:2 mol/L . H2SO4 50 μl.
C.2.3 結果判斷
在酶標儀上讀取492 nm(OPD)或450 nm(TMB/TMBS)吸光值,以待測樣本(S)對陰性對照血清(N)的S/N≥2.1為陽性臨界值。
C.3 間接紅細胞凝集試驗(IHA)
C.3.1 紅細胞醛化
從綿羊頸靜脈無菌採血100ml,加入200ml~400ml阿氏液(400ml三蒸水中溶解葡萄糖8.2g、NaCI 1.68g、檸檬酸三鈉2.4g和檸檬酸0.22g,調pH至6.1,高壓或過濾除菌)中,混勻抗凝。3000 r/min離心15 min,棄上清;
C.3.12 用生理鹽水洗滌紅細胞3次,同上離心。沉澱中加入50ml生理鹽水和100ml PBS(0.15 mol/L ,pH8.0)混勻;
C.3.13 加入經10% Na2CO3中和的戊二醛300ml(10% Na2CO3 75ml與25%戊二醛225ml混合)於磁力攪拌器4℃緩慢攪拌24 h;
C.3.14+ 離心棄上清,沉澱用生理鹽水洗滌5次。最後,將紅細胞沉澱用含0.1% NaN3的生理鹽水配成10%細胞懸液,4℃保存。
C.3.2 紅細胞致敏
C.3.2 1.將10%戊二醛醛化的綿羊紅細胞20ml 用生理鹽水300ml 洗3次(3000 r/min,5 min),紅細胞壓積約為2ml;
C.3.2 .2加入生理鹽水98ml,將紅細胞配成2%懸液100ml;
C.3.2. 3與1:10000鞣酸100ml混合於37 oC水浴30 min,每10 min混旋一次;
C.3.2. 4同步驟1離心洗3次,棄上清;
C.3.2. 5沉澱加入生理鹽水198ml,將鞣化紅細胞配成1%懸液200ml;
C.3.2. 6.與稀釋好的囊液抗原200ml 混合,37 ℃水浴30 min,每10 min混旋一次;
C.3.2. 7離心棄上清,用1%兔血清PBS(0.15 mol/L pH7.2 PBS)洗3次,棄上清;
C.3.2. 8 用10%兔血清PBS 18ml將紅細胞配成10%致敏紅細胞20ml.置4℃冰箱保存。
C.3.3 操作方法
準備抗原:用0.15 mol/L pH7.2 PBS將10%致敏紅細胞保存液稀釋至1%備用;
血凝板每孔加入25 μl PBS;
第一孔加入待檢血清25 μl,用移液器或稀釋棒從第一孔開始逐孔向後稀釋;
每孔加1%致敏紅細胞25 μl,振盪混合3 min,置37℃反應1h,判定結果;
C.3.3. 5.對照設置:每批試驗均應設置陽性、陰性和紅細胞對照(紅細胞對照孔只有PBS和致敏紅細胞)。
C.3.4 結果判斷
C.3.41 陰性反應:紅細胞全部沉入孔底呈點狀,邊緣光滑;
C.3.42陽性反應:++++ 100%紅細胞凝集;+++ 75%紅細胞凝集;++ 50%紅細胞凝集;+ 25%紅細胞凝集。
以血清1∶128稀釋出現陽性反應者(++)判為血清抗體陽性。
C.4 PVC薄膜快速ELISA
C.4.1 抗原
囊液粗抗原、純化抗原、特異性抗原
C.4.2 操作方法
取已包被好抗原的PVC薄膜軟板,編號,用PBST洗1次,然後每孔加PBST 200 μl;
加待檢血清及參考血清(每板作陰性對照一孔、陽性對照一孔)每孔10 μl,混勻,置濕盒37℃ 5 min(或25℃室温10 min)。傾去血清,用PBST連續洗8次,甩幹;
加酶標抗體:每孔加工作濃度酶標抗體 200 μl,37℃ 5 min,同上洗滌8次,再加蒸餾水洗一次,甩幹;
加底物顯色:每孔加TMB底物200 μl,反應5 min~10 min(TMB底物溶液的製備:TMB 50 mg溶於10ml二甲基亞碸中作為母液,4℃保存。用前取母液1ml+pH 5.0檸檬酸緩衝液50ml+30% H2O2 8 μl)。
C.4.3 結果判斷
參照陰性及陽性對照,用目視法判斷結果。陰性基本無色,陽性為鮮藍色。
C.5 免疫印跡技術(Western blot,WB)
C.5.1 抗原膜製備
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