生物化學綜合實驗習題解答精選

綜合實驗一 蛋白質的濃度測定—Bradford法

1．製作標準曲線及測定樣品時，為什麼要將各試管中溶液縱向倒轉混合？

答：(1)由於蛋白與考馬斯亮藍G-250染料的結合能力不同，縱向倒轉混合，充分反應。

(2)標準蛋白加入的量與考馬斯亮藍G-250的體積相差懸殊，縱向倒轉混合，充分反應。

2．查閲相關資料、文獻，舉例説明測定蛋白質的濃度的方法有哪幾種，並説明各自的優缺點。 答：主要的以下幾種：

（1）微量凱氏（Kjeldahl）定氮法，優點是測定準確率高，可測定不同形態的樣品。 缺點是測定過程繁瑣。

（2）雙縮脲法（Biuret法）

優點是較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用於需要快速，但並不需要十分精確的蛋白質測定。

（３）Folin—酚試劑法（Lowry法）

此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測蛋白質的靈敏度。這兩種顯色反應產生深藍色的原因是在鹼性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成複合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深藍色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

(４）考馬斯亮蘭法（Bradford法）

考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色。染料主要是與蛋白質中的鹼性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。在波長為595nm下測定的吸光度值A595，與蛋白質濃度成正比。

優點：a. 靈敏度高。b 測定快速、簡便，只需加一種試劑。c. 干擾物質少。

缺點： a 由於各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用於不同蛋白質測定時有較大的偏差，在製作標準曲線時通常選用g-球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。b.物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。c. 標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。

綜合實驗二 （1）酸性磷酸酯酶的提取

1、酸性磷酸酯酶在生物體內的作用是什麼？

答：酸性磷酸酯酶(Acid Phosphatase，)存在於植物的種子、黴菌、肝臟和人體的前列腺之中，能專一水解磷酸單酯鍵，如水解磷酸苯二鈉生成苯酚和無機磷。

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綜合實驗二 （2）酶促反應進程曲線的製作和初速度的測定

1、為什麼酶活力應該在進程曲線的初速度時間範圍內進行？

答：要進行酶的活力測定，首先要確定酶的反應時間。酶的反應時間並不是任意規定的，應該在初速度範圍內進行選擇。隨着反應時間的延長，曲線趨於平坦，曲線的斜率不斷下降，説明反應速度逐漸降低。反應時間延長以後底物濃度的降低和產物濃度的增高致使逆反應加強。因此，要真實反映出酶活力的大小，就應該在產物生成量與酶反應時間成正比這一段時間內進行初速度的測定。換言之，測定酶活力應該在進程曲線的初速度時間範圍內進行。

綜合實驗二 (3) 酶的活力測定

1、酶活力測定中為什麼各樣品與底物測定的時間要嚴格一致？

答：本實驗中用磷酸苯二鈉為底物。磷酸苯二鈉經過酸性磷酸酯酶作用，水解以後即生成酚和無機磷，其反應式如下：

O

||

C6H6-O-P-ONa + H2O ≒ C6H6-OH + Na2HPO4

|

ONa

由上式可見，當有足夠量的底物磷酸苯二鈉存在時，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的產物酚和無機磷也越多。反應速率只在反應的最七年級段時間範圍內保持恆定。隨着時間的延長，底物濃度的降低和產物濃度的升高，使逆反應加強。

綜合實驗二 (4) 酸性磷酸酯酶分子量的測定SDS-PAGE電泳法

1、為什麼要在樣品中加少許溴酚蘭和一定濃度的甘油溶液？甘油及溴酚蘭的作用分別是什麼？

答：加少許溴酚蘭的目的是作指示劑，用來反映在電泳的過程中樣品蛋白質遷移的長度。加入甘油的作用是甘油的密度較大，對樣品中的蛋白質起沉澱作用。

2、影響遷移率的因素有哪些？

答：①SDS的濃度，溶液中的SDS的總量至少要比蛋白質的量要高三倍，一般高達10倍以上。 ②溶液的離子強度，溶液的離子強度應較低，最高不能超過0.26，在低離子濃度中SDS單體具有較高的平衡濃度。

③二硫鍵是否完全被還原，只有在蛋白質分子內的二硫鍵被徹底還原的條件下才能準確測定。在有些情況下，還需要進一步將形成的巰基烷基化。

④每次樣品測定必須同時做標準曲線，而不得利用另一塊電泳的標準曲線。

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　綜合實驗三 動物組織DNA提取及純度檢測

1、DNA提取的原理是什麼？

答：真核生物的DNA是以染色體的形式存在於細胞核內，提取DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類等分離和保持DNA分子的完整。提取DNA過程是將分散好的組織細胞在含SDS（十二烷基硫酸鈉）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質，再用酚和氯仿或異戊醇抽提分離蛋白質，得到的DNA溶液經乙醇沉澱使DNA從溶液中析出。蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在下保持很高的活性。在勻漿後提取DNA的反應體系中，SDS可破壞細胞膜、核膜，並使組織蛋白與DNA分離，EDTA則抑制細胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。

2、試分析DNA樣品不純的原因？

答:①裂解液要預熱,以抑制DNase,加速蛋白變性,促進DNA溶解，②各操作步驟要輕柔,儘量減少DNA的人為降解，③取各上清時,不應貪多,以防非核酸類成分干擾，④異丙醇,乙醇,KAC等要預冷,以減少DNA的降解,促進DNA與蛋白等的分相及DNA沉澱。

　　綜合實驗四 大腸桿菌感受態細胞製備及外源DNA的'轉化

1、氨苄青黴素篩選轉化子的原理是什麼？

答：外源DNA轉化是以 DH5α 菌株為受體細胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處於為感受態，然後與 pUC18質粒共保温實現轉化。 pUC18質粒攜帶有抗氨苄青黴素的基因，使接受了該質粒的受體菌具有抗氨苄青黴的特性。將經過轉化後的全部受體細胞經過適應稀釋，在含氨苄青黴素的平板培養基上培養，只有轉化體才能存活，而未受轉化的受體細胞則因無抵抗氨苄青黴素的能力而死亡。

2、影響轉化的因素有哪些？

答：(1）細胞生長狀態和密度：不要用經過多次轉接或儲於4℃的培養菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用於製備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時，細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同)，密度過高或不足均會影響轉化效率。

（2）質粒的質量和濃度: 用於轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA(cDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定範圍內成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，轉化效率就會降低。一般情況下，DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5％。

（3）試劑的質量: 所用的試劑，如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.)，並用超純水配製，最好分裝保存於乾燥的冷暗處。

（4）防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行， 所用器皿， 如離心管， tip頭等最好是新的，並經高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染， 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入。